螺旋藻 C - 藻蓝蛋白亚基分离及抗肿瘤活性研究,藻蓝蛋白,浙江台州宾美生物科技有限公司0576-85795755
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藻蓝蛋白是蓝藻、 红藻等藻类的主要集光分子,传光效率极高大量研 究表明, 藻 蓝蛋白 具有抗氧化、 清除自由基抗炎 症、 抗 瘤等 作用,能有效预防和治疗多种疾病. 藻蓝蛋白已广泛应用于食品、 化妆品、 医药等领域. 根据其来源不同, 可将藻蓝蛋白 分为 C - 藻 蓝蛋 白( C - P C) 和 R - 藻蓝蛋 白( R - PC) .近年来, 国外有大量文献报道了藻蓝蛋白的抗瘤活性, 以及藻蓝蛋白诱发细胞调亡的原理, 引起了国内外广泛的兴趣. 但是, 对藻蓝蛋白亚基的分离少见报道. 本文运用热变性的方法, 从钝顶螺旋藻中分离出 C - 藻蓝蛋白, 研究获得组成其的两个亚基A和 B , 并考察藻蓝蛋白亚基对肺腺癌细胞的生长抑制作用, 以期为藻蓝蛋白亚基的研究开发提供依据.

1   材   料

材料: 钝顶螺旋藻( S p i r u l in a p l at en s i s ) 购自江苏溧阳; 人源肺腺癌 S P C - A 1 细胞株, 购自中科院细胞所.

试剂: CCK - 8 试剂盒 ( Cell Cou nt in g K it - 8 ) , 日本同仁化学研究 所; R PM I - 164 0 液体 培养基, 吉诺生物有限公司; 胰酶 - EDT A , 吉诺生物有限公司; 超级新生牛血清, 杭州四季青生物公司.

仪器: Bio40 紫外/ 可见分光光度计, 美国 Per k in Elmer 公司, 85 0 型荧光分光光度仪, 日本 H ita ch i 公司, 微型蛋白质电泳系统, 美国 Bio - R ad 公司.

2   实验方法

2. 1   藻蓝蛋白的分离纯化

取螺旋藻藻泥 10 0 g 左右, 加入 pH 6. 8 的磷酸缓冲液, 4 e 保存过夜. 待其完全融解后, 超声破碎.温水浴热变性后, 30 % ~ 65% 硫酸铵盐析, 离心去上清. 沉淀用 P BS 溶解, 透析脱盐后, 羟基磷灰石柱层析, 使用文献报道的自制羟基磷灰石[ 6- 7]. 得到 1 g左右的藻蓝蛋白( A 620 / A 280 > 4. 0 ) , 再次羟基磷灰石层析, 藻蓝蛋白纯度 进一步提高, 得到 A 620 / A 280 >4. 5 的高纯度藻蓝蛋白, G 25 脱盐, 冻干粉保存.

2. 2   藻蓝蛋白亚基的分离

取新鲜制备的藻蓝蛋白( A 620 / A 28 0 > 4. 5) 溶液用硫酸铵盐析, 4 e 静置过夜, 冷冻离心, 弃上清. 沉淀溶于醋酸缓冲液中, 避光低温保存 1 d. 第 2 天可见藻蓝蛋白颜色由亮蓝色变为绿色. 溶液用含8 mol # L- 1脲的醋酸缓冲液透析, 直至无硫酸铵.cM - Sep har os e F. F . 离子交换层 析, 层析 柱用含 8M 脲的醋酸缓冲液预平衡, 离子强度梯度洗脱,洗脱 液 为 0 ~ 0. 2 mo l # L- 1N a Cl 的 醋 酸 缓 冲液[ 8- 10].分别收集两个蛋白峰, 采用透析复性的方法对两者复性. B 亚基较易复性, 直接置于 2 M 脲的醋酸缓冲液中透析复性. A亚基复性较难, 在连续脲梯度的醋酸缓冲液中进行复性, 控制适当的浓度变化率,获得较好的复性效果. 复性效果可以通过紫外和荧光光谱观测.

2. 3   藻蓝蛋白及其亚基对肺腺癌细胞 S PC - A - 1生长的影响

2. 3. 1   肺腺癌 S P C - A - 1 细胞的培养

用含 有 10% 的 热灭 活 新生 牛血 清 的 R PM I -16 40 培养基, 3 7 e 、 饱和湿度、 5% CO2 的培养箱中培养至对数生长期后用于实验.

2. 3. 2   细胞毒性分析

用日本 同 仁化 学 研究 所 的 CCK - 8 试 剂盒 检测. 取长至 7 ~ 8 成满 的细胞消化 离心, 制成悬液, 每孔 8 0 L L 接种于 96 孔板, 使每孔约 3 000 ~4 000 个细胞. 培养 24 h 后, 加入不同浓度的 2 0 L L的 C - PC、 A亚基 和 B 亚 基以获 得所需 的终浓 度梯度, 蛋白质浓度用 F olin - 酚法确定, 每个浓度设 5 个复孔, 并设不加药物的阴性对照和不加细胞的空白对照. 分 别 以不 同的 时 间梯 度 进行 培 养后, 加入10 L L CCK - 8 试剂, 置饱和湿度培养箱培养 2 h 后,用酶标仪在 45 0 n m 下测吸光值.按以下公式计算抑制率:细胞抑制率= ( 阴性对照组- 实验组) / ( 阴性对照- 空白对照) .用 S 统计对数据进行分析[ 10].

3   结   果

3. 1   藻蓝蛋白亚基的分离结果

离子交换层析结 果可见两个明显的蛋白收集峰, 如图 1 所示. 经 SD S 聚丙烯酰胺电泳确定, 其中先出峰的是 B 亚基, 后出峰的为 A亚基, 分离达到电泳单一条带.

流速: 0. 5 mL # min- 1, 洗脱梯度: 0~ 0. 2 m o l # L- 1N a Cl 的醋酸缓冲液, 各 150 mL 连续梯度洗脱

3. 2   藻蓝蛋白及其亚基的紫外可见光谱分析变性状态下藻蓝蛋白及其亚基三者的紫外可见光谱很相似( 见图 2 ) . 复性后三者的区别较明显( 见图 3) , 可见区藻蓝蛋白的最大吸收峰为 620 nm , 而且在 600 n m 处还有一个明显的肩峰; A亚基最大吸收峰为 62 4 n m; B 亚基最大吸收峰为 610 nm . 由图证明亚基的复性已经比较成功.

3. 3   荧光光谱图

A亚基的最大激发波长为 6 10 n m, 最大发射峰642 n m( 见图 4 ( a) ) , 另外 2 80 n m 的光也能够激发 A亚基的荧光, 最大发射峰依然为 6 42 nm. B 亚基最大激发波长为 62 3 nm , 最大激发峰 65 0 nm  . 藻蓝蛋白的荧光最大发射峰为 64 8 n m.

3. 4   S DS - 聚丙烯酰胺凝胶电泳

参照5分子克隆实验指南6配制 15% 的分离胶,采用 10 V # c m- 1的电压跑电泳, 考马斯亮蓝染色,电泳结果显示( 见图 5) 两个亚基分离成功, 在 S DS -聚丙烯酰胺凝胶电泳显示为一条带。

3. 5   C - PC 及其亚基对 S PC - A1 细胞生长的影响

C - P C 对该细胞的生长有抑制作用, 并有良好的时间和剂量关系( 见图 6 ( a) ) . 较高浓度的 C - PC 有显著的抑制作用, 40 L mo l # L- 1的 C - PC 处理细胞24 h 后, 细胞存活率降至 67 . 75% ; 60 L mo l # L- 1的C - P C 处理细胞 24 h 后, 细胞存活率仅为 3 4. 1 0% .

但是, 较低浓度的 C - PC 对 S PC - A - 1 细胞的杀伤效果则明显较弱, 10 L mol # L- 1的 C - PC 处理该细胞 48 h后, 细胞存活率为 81. 50% ; 而 5 L mol # L- 1的 C - PC处理该细胞 48 h 后, 细胞存活率仍高达90. 11% .A亚基对 S P C - A - 1 细胞的生长有一定的抑制作用, 2 0 L m ol # L- 1的 A亚基处理该细胞 48 h 后存活率与对照细胞相比降为 75. 3 2% , 总体效果 与相同摩尔浓度的 C - PC 杀伤效果相当( 见图 6 ( b ) ) ,B 亚基对 S PC - A - 1 细胞生长的影响, 与相同摩尔浓度的 C - PC 和 A亚基相比( 见表 1) , B 亚基对该细胞具有 更显著 的杀伤 效果, 具有 良好 的剂量 和时间关系. 10 L mol # L- 1浓度的 B 亚基处理该细胞2 4 h 后存活率降为 45 . 30 % , 20 L m ol # L- 1的 B 亚基处理该细胞 4 8 h 后, 细胞存 活率仅为 1 3. 6 9% ,提示 B 亚基 作为 抗肿 瘤 药物 的良 好潜 力。

4   结   论

藻蓝蛋白是一种普遍存在于蓝藻中, 含开链四吡咯结构的天然色素蛋白. 藻蓝蛋白亚基与藻蓝蛋白性质相近, 但是亚基分子量小, 更容易直达病灶,与细胞发生作用. 本文第 1 次在藻蓝蛋白的分离中运用热变性的方法, 简化了藻蓝蛋白的提取方法, 降低了生产成本.通过脲变性、 CM - Sep har os e F. F . 阳离子 交换层析与透析复性得到电泳单一条带的亚基. 得到的亚基保持了藻蓝蛋白原有的光 谱学性质和荧 光性质, 三者可见区吸收峰在 620 nm 附近, 荧光最大发射峰很接近, 都在 6 40 n m 和 65 0 n m 之间. 这证明了此方法分离 C - P C 亚基行之有效.变性状态下藻蓝蛋白及其亚基三者的紫外可见光谱很相似, 可以说基本没有什么大的区别, 这是由于在变性条件蛋白质处于舒展状态, 发色团周围氨基酸对发色团的影响不大即发色团所处的环境为溶液环境, 所以三者的光谱学性质接近. 复性后三者的区别较明显, 说明亚基的复性比较成功, 发色团的发色受到了周围氨基酸环境的影响.藻蓝蛋白对肿瘤细胞具有直接杀伤作用, 国内外已有文献报道. 李冰等[ 11]认为, 藻蓝蛋白 具有抗肿瘤效应, 其机理可能是藻蓝蛋白作为一种有丝分裂原, 可与肿瘤细胞表面的有丝分裂受体结合, 通过受体的交联和蛋白激酶活化从而促进细胞内 CD59基因的转录表达, 诱导死亡结构域的活化, 从而抑制肿瘤细胞的增殖, 促进肿瘤细胞的凋亡. 亚基的分子量小, 更容易与细胞表面受体 结合, 与 细胞发生作用, 因此亚基具有更好的抗癌效果, 特别表现在 B 亚基. 5 L mol # L- 1B 亚基浓度作用 4 8 h 后的抑制率已经达到 59. 6 9% , 具有很好的抗肿瘤潜力. 这为藻蓝蛋白抗肿瘤药物的开发研究奠定了基础.由于提取工艺比较复杂, 特别是工艺中包含了蛋白质的变性复性, 导致亚基的质量不是很稳定, 限制了进一步研究和实际应用. 此外, A亚基对该细胞株的生长抑制与藻蓝蛋白差不多, 这意味着三者与细胞的作用效果除受分子大小的影响还受其它因素的影响, 需要进行进一步的研究和探讨.

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